Système d'expression inductible au cumate dans les cellules eucaryotes (L-11648 & 11225)

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Ce système d'expression permet de déclencher l'expression d'une protéine en cas de besoin seulement. Ceci s'avère particulièrement important dans la production de protéines ayant la capacité de ralentir ou même d'inhiber la croissance des cellules utilisées pour produire ces mêmes protéines. Ce système d'expression trouve aussi des utilités là où il peut s'avérer nécessaire de cesser ou de reprendre la production des protéines à un moment précis, en thérapie génique humaine, par exemple.

Applications

• Production de protéines thérapeutiques et de vecteurs viraux en culture cellulaire.
• Essais cellulaires.
• Applications potentielles en thérapie génique.

Concept

Le système d'expression inductible au cumate possède trois configurations soit celles du Répresseur, du Transactivateur et du Transactivateur inversé. Dans la configuration Répresseur, la molécule répressive CymR est utilisée afin d'empêcher la transcription par un promoteur mammifère (CMV5) en se liant à l'opérateur cumate (CuO) situé en aval du site d'initiation. Par contre, l'introduction d'un inducteur (le cumate) à une concentration qui est non toxique pour les cellules de mammifères, apporte des changements dans la configuration du CymR. Par conséquent, cette molécule ne peut désormais se lier à la séquence en nucléotides de l'opérateur ce qui relâche la répression et induit la production de la protéine désirée (voir le diagramme portant sur la configuration Répresseur). Dans la configuration Transactivateur, un transactivateur chimérique (cTA) a été conçu par la fusion du CymR, en tant que domaine de liaison à l'ADN, avec le domaine d'activation VP16. Un promoteur chimérique, le CR5, fut également créé par l'insertion de 6 copies de CuO en aval du promoteur minimal CMV. Cet arrangement permet que le promoteur CR5 ne soit activé seulement qu'en l'absence de cumate (voir le diagramme portant sur la configuration Transactivateur). Finalement, une molécule CymR inverse, qui se lie à CuO en présence de cumate plutôt qu'en son absence, a été obtenue par mutagénèse. La fusion de ce CymR inverse avec VP16 donne lieu à la formation d'un transactivateur inversé capable d'activer l'expression d'un gène d'intérêt par le promoteur CR5 en présence de cumate (voir le diagramme portant sur la configuration Transactivateur inversé). La capacité de réguler l'expression d'un gène cible par l'une de ces trois configurations accroît la versatilité de ce système qui peut servir à de nombreuses applications.

Avantages

Choix du moment de l'induction
Ce système novateur peut demeurer fermé (expression " off ") jusqu'à ce qu'il y ait assez de cellules pour produire un lot de protéines qui autrement inhiberaient la croissance des cellules du bioréacteur.

Réponse post-induction rapide
Le système d'expression inductible au cumate peut être rapidement activé (expression " on ") par l'ajout de cumate dans ses configurations Répresseur et Transactivateur inversé.

Efficace en termes de coût et de temps
Ce système permet de réduire le temps et les coûts lors de la production à grande échelle de protéines. Ce système est particulièrement intéressant en termes de coûts lorsque la protéine désirée inhibe la croissance des cellules productrices. L'énergie ainsi que les sources de carbone peuvent ainsi être utilisés uniquement à l'expansion du nombre de cellules du bioréacteur avant l'induction.

Compatible avec d'autres systèmes d'induction
Ce système peut être combiné avec d'autres systèmes d'induction afin de permettre l'expression séquentielle de multiples protéines.

Contrôle sur l'expression de gènes en cellules de mammifères
Ce système permet la production inductible de protéines dans des lignées de cellules importantes au niveau commercial comme les cellules CHO ou les 293. De plus, ce système peut être utilisé afin de contrôler l'expression in vivo de gènes lors d'études expérimentales sur l'animal.

Un effecteur sûr
Cette technologie utilise le cumate comme inducteur, qui est non toxique pour les cellules mammifères.

Propriété intellectuelle

Système d'expression, composants de ce système d'expression, et procédés d'utilisation (no CNRC 11648); Système destiné à l'expression inductible dans des cellules eucaryotes (no CNRC 11225).

Contacts

Information pertinente

Système d'expression inductible au cumate dans les cellules eucaryotes (L-11648 & 11225)

Instituts:

• Institut de recherche en biotechnologie du CNRC