Profilage des hormones végétales à l'IBP

L'IBP propose le profilage des hormones végétales en tant que service ou travail en collaboration avec les spécialistes en biologie végétale. Les techniques d'analyse permettent de quantifier un grand nombre de molécules signalisatrices des plantes à partir du même échantillon, grâce à des étalons internes servant de marqueurs. La méthode d'analyse privilégiée par l'IBP-CNRC minimise la manipulation des échantillons tout en autorisant l'extraction des divers types de molécules signalisatrices parmi la multitude de métabolites secondaires présents chez la plante. Après une extraction et une purification préliminaires, les scientifiques de l'institut recourent à la CLHP ainsi qu'à la spectrométrie de masse en tandem pour identifier et quantifier les molécules signalisatrices peu abondantes.

Les composés ciblés comprennent des hormones biologiquement actives, leurs précurseurs et leurs métabolites inactifs, qui renseignent tous sur le bilan hormonal de la plante. Les scientifiques de l'institut s'efforcent constamment d'élargir la portée de cette méthode. À l'heure actuelle, une seule expérience permet l'identification d'une vingtaine d'hormones. Nous pouvons aussi analyser la voie d'une hormone unique, quand un problème biologique précis le requiert.

Les hormones végétales régulent l'expression des gènes au moyen de systèmes de signalisation complexes. Le profil hormonal peut être intégré aux données de génomique, protéomique et métabolomique pour brosser une vue d'ensemble des mécanismes biologiques des végétaux.

Nos objectifs

• Procurer un service d'analyse des hormones végétales aux spécialistes en biologie végétale.
• Poursuivre le perfectionnement de la méthode d'analyse employée pour quantifier un grand nombre d'hormones végétales simultanément.
• Étudier la concentration et les voies des hormones végétales dans les tissus afin de compléter les recherches en génomique et en protéomique sur les changements observés au niveau de l'expression des gènes et du profil des protéines.

Description du profilage des hormones

Approche générale

• Chaque composé est analysé à l'état naturel, sans procédures de dérivation.
• Les composés sont séparés par CLHP puis détectés par spectrométrie de masse en tandem.
• Les métabolites et les hormones sont analysés par électronébulisaton des ions positifs ou négatifs en une seule passe de chromatographie liquide et de spectrométrie de masse (LC-MS/MS).

Matériel végétal

Pour l'analyse des auxines, des cytokines, des gibbérellines, de l'acide abscissique et de leurs métabolites, il faut au moins 50 mg de tissu végétal cryolyophilisé par analyse. Pour doser l'acide jasmonique ou l'acide salicylique, au moins 500 mg de tissu végétal frais congelé sont nécessaires. Le biologiste détermine combien d'essais il faut effectuer. L'institut a quantifié les hormones végétales de plusieurs espèces végétales (canola, raisin, conifères, maïs, soja, etc.) à partir de matériel varié comme des graines, des fruits, des baies, des feuilles, des racines, des tiges, des méristèmes, des bourgeons et de la sève.

Diagramme du profilage des hormones végétales

1. Les étalons créés à l'institut et marqués avec des isotopes pour la quantification des hormones sont ajoutés à l'échantillon avant l'extraction pour tenir compte des pertes d'analytes.
2. La méthode d'extraction se prête à tous les métabolites et hormones des plantes, malgré leurs différences chimiques (à savoir, polarité, acidité). De cette façon, la manipulation de l'échantillon est réduite au minimum et aucune dérivation n'est nécessaire.
3. Couplée à la spectrométrie de masse en tandem (SM/SM), la CLHP est une méthode d'analyse très sélective et très sensible qui permet de quantifier les hormones végétales malgré l'abondance des métabolites secondaires.
4. Cette méthode doit sa sélectivité et sa sensibilité à la surveillance des multiples réactions.
5. Les résultats sont présentés sous forme de tableau Excel. La concentration de chaque hormone est indiquée en ng par gramme de matériel végétal sec ou congelé.

Pour l'instant, une** seule expérience permet de doser les substances que voici :

ABA acide abscissique
PA acide phaséique
DPA acide dihydrophaséique
ABA-GE glucose-ester de l'acide abscissique
7'OH-ABA acide 7'-hydroxy-abscissique
neo-PA acide neo-phaséique
IAA acide indole-3-acétique
IAA-Asp aspartate de l'acide indole-3-acétique
IAA-Glu glutamate de l'acide indole-3-acétique
IAA-Ala N-(indole-3-yl-acétyl)-alanine
IAA-Leu N-(indole-3-yl-acétyl)-leucine
Z, cis and trans zéatine, cis et trans
ZR, cis and trans riboside de la zéatine, cis et trans
2iP isopentényladénine
IPA isopentényladénosine
DHZ dihydrozéatine
DHZR riboside de la dihydrozéatine
ZOG, cis and trans O-glucoside de la zéatine, cis et trans
GA n gibbérelline n
JA acide jasmonique
SA acide salicylique

Services

Profilage des hormones végétales

L'institut analyse le profil hormonal du matériel végétal. Les chercheurs peuvent obtenir le profilage d'un groupe précis d'hormones ou de plusieurs groupes.

Étalons marqués aux isotopes

L'institut utilise de l'ABA et des métabolites de l'ABA marqués ou pas avec des isotopes comme étalons pour la spectrométrie de masse ou les études sur les substances administrées dans les aliments.

Équipement

• Spectromètre de masse en tandem Micromass Quattro LC quadrupolaire et système de CLHP Agilent 1100 pour l'analyse massive de biopolymères, la quantification et l'analyse structurale des petites molécules par APcI, ESI MS ou MS/MS.
• Spectromètre de masse en tandem Waters Quattro Premier XE quadrupolaire et système UPLC pour la quantification précise et le profilage des métabolites végétaux par ESI MS/MS.

Publications sur le profilage des hormones

Argyris, J., Dahal, P., Hayashi, E., Still, D.W. et Bradford, K.J. 2008. Genetic Variation for lettuce seed thermoinhibition is associated with temperature-sensitive expression of abscisic acid, gibberellin, and ethylene biosynthesis, metabolism, and response genes. Plant Physiology, 148, 926 – 947.

Huang, D., Wu, W., Abrams, S.R. et Cutler, A.J. 2008. The relationship of drought-related gene expression in Arabidopsis thaliana to hormonal and environmental factors. Journal of Experimental Botany, 59, 2991 – 3007.

Kong, L., Abrams, S.R., Owen, S.J., Graham, H. et von Aderkas, P. 2008. Phytohormones and their metabolites during long shoot development in Douglas-fir following cone induction by gibberellin injection. Tree Physiology 28, 1357 – 1364.

Malik, M.R., Wang, F., Dirpaul, J.M., Zhou, N., Hammerlindl, J., Keller, W., Abrams, S.R., Ferrie, A.M.R. et Krochko, J.E. 2008. Isolation of an embryogenic line from non-embryogenic Brassica napus cv. Westar through microspore embryogenesis. Journal of Experimental Botany, 59, 2857 – 2873.

Huang, D., Jaradat, M.R., Wu, W., Ambrose, S.J., Ross, A.R.S., Abrams, S.R. et Cutler, A.J. 2007. Structural analogs of ABA reveal novel features of ABA perception and signaling in Arabidopsis. The Plant Journal 50, 414 – 428.

Belmonte, M.F., Ambrose, S.J., Ross, A.R.S., Abrams, S.R. et Stasolla, C. 2006. Improved development of microspore-derived embryo cultures of Brassica napus cv Topaz following changes in glutathione metabolism. Physiologia Plantarum 127: 690 – 700.

Bonham-Smith, P.C., Gilmer S., Zhou, R., Galka, M. et Abrams, R.S. 2006. Non-lethal freezing effects on seed degreening in Brassica napus. Planta 224: 145 – 154

Priest, D.M., Ambrose, S.J., Vaistij, F.E., Elias, L.,Higgins, G.S., Ross, A.R.S., Abrams, R.S. et Bowles, D.J. 2006. Use of the glucosyltransferase UGT71B6 to disturb abscisic acid homeostasis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 46, 492 – 502.

Information pertinente

Instituts:

• Institut de biotechnologie des plantes du CNRC